Thursday, 10 January 2013

Kiat Pemeliharan Kolom HPLC : Dalam Kaitannya Dengan Kualitas Pelarut

KIAT PEMELIHARAN KOLOM HPLC : DALAM KAITANNYA DENGAN KUALITAS PELARUT


I.            Pendahuluan
Banyak faktor harus diperhatikan di dalam menggunakan kolom, agar kolom dapat berfungsi dengan baik dalam waktu yang relatif panjang. Salah satu faktor yang harus diperhatikan  adalah kualitas pelarut yang digunakan, baik sebagai eluen, larutan pencuci kolom atau pelarut untuk menyimpan kolom. Uraian di bawah ini akan memberikan petunjuk bagaimana memilih kualitas pelarut yang akan digunakan, bagaimana menyiapkan campuran pelarut yang akan dipakai  sebagai eluen, bagaimana membuat dan menggunakan larutan buffer, yang juga sering dipakai sebagai eluen pada HPLC. Akan diuraikan pula apa pengaruh kecepatan aliran eluen serta tekanan yang diakibatkan olehnya terhadap kolom. Dan yang terakhir, bagaimana cara membersihkan dan memperbaiki unjuk kerja (perfomance) suatu kolom, dalam arti; jenis pelarut apa saja yang umum digunakan utnuk mencuci dan meregenerasi kolom dan bagaimana cara melakukannya (1).



II.           Kualitas Pelarut
Pada HPLC, sebagai eluaen umumnya digunakan pelarut organik, air dan bahkan kadang-kadang digunakan pula larutan penyangga (buffer).

II.1. Pelarut Organik
Dewasa ini kita cukup beruntung karena telah banyak tersedia dipasaran jenis pelarut “chromatographic grade”. Pelarut kenis ini telah dimurnikan secara khusus sehingga bebas dari pengotor yang menyerap sinar ultraviolet dan pertikel-partikel. Karena biasanya pelarut “chromatographic grade” hanya bebas dari partikel dan pengotor yang menyerap ultraviolet, maka pelarut tersebut masih mengandung sejumlah tertentu air. Pada pemakaian kolom silika atau kolom fasa terikat polar seringkali dibutuhkan pelarut yang benar-benar kering (bebas air). Untuk keperluan tersebut pelarut yang akan dipakai perlu dikeringkan secara khusus dengan jalan menambahkan molecular sieves. Molecular sieves  yang sudah dipakai dapat dikeringkan dan digunakan kembali hingga beberapa kali, hanya saja penggunaannya harus selalu untuk jenis pelarut yang sama.

II.2. Pelarut Air
Dengan berkembangnya fasa terikat tak polar, maka air banyak digunakan sebagai salah satu campuran eluen. Kolom yang banyak digunakan pada jenis kromatografi fasa terbalik ini, seperti kolom RP-18 dan RP-8 mempunyai affinitas relatif besar terhadap senyawa-senyawa tak polar. Kolom tersebut dapat mengumpulkan pengotor-pengotor organik (yang sifatnya tak polar) yang terdapat dalam air. Terlebih lagi, apabila eluen yang digunakan mengandung presentasi air yang cukup besar. Terkumpulnya kotoran tadi berjalan secara terus menerus selama eluen dialirkan masuk ke dalam kolom. Pengotor mula-mula akan menyelimuti fasa C18 sehingga dapat mengubah selektifitas dan mempengaruhi pemisahan pada kolom. Jika konsentrasi pengotor ini makin bertambah, suatu saat pengotor tersebut akan terelusi keluar dari kolom berupa puncak-puncak palsu dan asing (puncak yang bukan berasal dari contoh yang diinjeksikan). Terelusinya pengotor ini dapat pula terjadi pada saat digunakan eluen dengan daya elusi lebih kuat seperti yang sering terjadi pada elusi gradien.
Air deionisasi sederhana umumnya masih mengandung pengotor organik, oleh karena itu untuk dapat digunakan sebagai campuran eluen, air tersebut masih harus dibebaskan dari pengotor-pengotor organik dengan jalan mengalirkannya melalui kolom karbon (carbon catridge), kolom fasa terikat C18atau dengan jalan mendestilasi air tersebut dengan cara destilasi permanganat (2, 3, 4). Baru setelah itu air tersebut dapat dikategorikan sebagai air “chromatographic grade”.

II.3. Garam dan Larutan Buffer
Untuk keperluan kromatografi pasangan ion, banyak pemisahan dilakukan dengan menggunakan eluen berupa larutan buffer atau larutan garam. Namun demikian masih sedikit sekali tersedia larytan-larutan tersebut di atas dengan kualitas “chromatographic grade”. Kebanyakan larutan tersebut masih mengandung partikel-partikel atau pengotor yang menyerap sinar ultraviolet. Oleh karena itu, eluen yang mengandung garam tidak boleh lupa harus selalu disaring melalui filter membran. Pengotor organik yang terdapat pada garam dapat teradsorpsi pada kolom yang biasa digunakan untuk jenis kromatografi fasa terbalik. Cara menghilangkan pengotor tersebut dapat dilakukan dengan jalam mengalirkan larutan garam yang akan dipakai pada kolom fasa terikat tak polar terlebih dahulu, sebelum dialirkan pada kolom yang akan digunakan untuk pemisahan (5).
Kolom yang dialiri oleh eluen berupa larutan buffer hendaknya disediakan tersendirir, karena agar dapat dipakai untuk sistem eluen yang lain, kolom harus dibilas bersih dengan air, dengan maksud mengusir secara total semua garam yang terdapat dalam kolom tersebut. Hal ini sukar dicapai; hampir selalu masih terdapat sisa garam di dalam kolom dan pada saat ke dalam kolom akan mengendap. Pengendapan yang terjadi dapat menyebabkan kerusakan pada paking kolom.
Larutan buffer hendaknya disimpan dalam lemari es, guna mencegah pertumbuhan bakteri dan jangan sekali-kali menyimpan kolom dalam keadaan masih terisi larutan buffer. Kebanyakan perusahaan selalu menuliskan pada buku petunjuk pemakaian alat, untuk tidak menggunakan garam halogen atau asam halogen sebagai campuran eluen, karena dapat menyerang/merusak tabung kolom yang terbuat dari stainless steel. Padahal di dalam prosedur pemisahaan kromatografi sering ditemukan pemakaian garam tersebut sebagai campuran pada eluen (6, &). Jika dengan terpaksa harus digunakan garam atau asam halogen, maka sebaiknya setiap satu bulan sekali, ke dalam pompa dialirkan larutan HNO3 20-50%. Larutan asam sebanyak ± 20 ml dipompakan ke dalam sistem kromatografi tanpa melalui kolom pengaman dna kolom analitik dengan kecepatan aliran 0,1 ml/menit. Kemudian ke dalam peralatan tadi dipompakan kembali air hingga eluen yang keluar mempunyai harga pH = 7. Larutan asam, basa atau buffer tidak boleh berada dalam peralatan atau kolom, walaupun hanya untuk satu malam.
Sebelum dialirkan ke dalam kolom, selalu dianjurkan untuk menyaring eluen dan menghilangkan gelembung yang mungkin terdapat pada eluen. Hal ini berlaku baik bagi campuran pelarut organik murni, larutan buffer maupun pelarut yang mengandung garam (untuk keperluan kromatografi pasangan ion). Filter digunakan mula-mula harus dicuci terlebih dahulu dengan sejumlah tertentu eluan dan filtrat hasil cucian dibuang. Filtrat yang mula-mula ini biasanya mangandung senyawa pengikat (binder), penstabil (stabilizer) dan pengotor (impurity) yang mungkin terdapat pada berbagai membran. Selain itu, daya matriks membran terhadap berbagai pelarut organik harus diuji terlebih dahulu, karena ada beberapa jenis membran yang dapat larut oleh pelarut tertentu.

III.         Pengaruh dari Kecepatan Aliran Eluen dan Tekanan terhadap Kolom
Dari bentuk kurva Van Deemter untuk kromatografi cairan dapat dilihat bahwa jika kecepatan aliran berkurang, efisiensi pemisahan bertambah tinggi. Karena itu waktu pemisahan dapat  diubah agar efisiensi pemisahan maksimum.
Kecepatan aliran eluen yang umum digunakan berkisar antara 1-4 ml/menit. Untuk hasil yang optimal harus dicapai kompromi yang baik antara efisiensi pemisahan dan waktu analisa. Atwood (8) mengamati bahwa jika kecepatan aliran eluen polar atau ionik bertambah, maka kecepatan pelarutan silika juga bertambah cepat. Oleh karena itu kecepatan aliran yang relatif lambat dapat memperpanjang waktu hidup kolom. Masalahnya, kolom dengan daya resolusi tinggi (efisiensi tinggi) mengandung butir-butir partikel fasa diam yang sangat kecil. Dengan kolom jenis ini dibutuhkan waktu pemisahan (waktu analisa) yang relatif lama. Akibatnya terdapat kecenderungan untuk mempertinggi kecepatan aliran eluen guna mempersingkat waktu analisa. Cara ini sebaiknya tidak dilakukan dan sebagai penggantinya ditempuh jalan atau menggunakan kolom yang lebih pendek atau mempertinggi kekuatan elusi fasa gerak. Dengan demikian waktu analisa dapat dipersingkat, tanpa mengorbankan waktu hidup kolom tersebut.
Kolom HPLC diisi (dipaking) pada tekanan antara             4000-15000       psi dan karenanya kolom tersebut sebenarnya cukup tahan terhadap tekanan yang bisa digunakan pada operasi kromatografi (1000-4000 psi). Meskipun demikian, perubahan tekanan yang terlalu mendadak dapat merusak paking kolom. Oleh sebab itu perubahan tekanan, baik dari tekanan tinggi ke rendah atau sebaliknya dari tekanan rendah ke tinggi harus berlangsung secara bertahap dan perlahan-lahan. Hal ini harus selalu diperhatikan, terutama pada kolom dengan partikel berukuran kecil (5 μm), karena tekanan balik (back pressure) dari kolom jenis ini relatif besar.
Seringkali pada waktu mengkondisikan kolom digunakan kecepatan aliran eluen yang cukup besar dengan maksud agar kesetimbangan kolom dapat lebih cepat tercapai. Dalam hal ini hendaknya diingat bahwa hubungan antara kecepatan aliran dan tekanan sebanding. Makin tinggi kecepatan aliran, maka tekanan balik yang dihasilkan makin tinggi pula. Perubahan tekanan dapat juga terjadi sebagai akibat perubahan viskositas eluen, karena berubahnya komposisi eluen yang dialirkan ke dalam kolom.
Tekanan balik yang makin besar seringkali dihasilkan oleh kolom yang sudah “tua”, karena mengumpulnya pengotor-pengotor baik pada kolom ataupun kololom pengaman. Jenis pelarut apa yang digunakan untuk membersihkan kolom akan diuraikan kemudian.



IV.               Pelarut untuk Mencuci Kolom
Pelarut yang digunakan utnuk mencuci harus mempunyai kualitas yang sama dengan pelarut yang dipakai pada pemisahan kromatografi. Jumlah pelarut yang dibutuhkan kira-kira 20 kali volume mati kolom (V0). Larutan pencuci yang digunakan harus larut baik di dalam larutan pencuci yang dialirkan sebelumnya dan larutan pencuci yang akan dipakai kemudian. Jika dalam campuran eluen digunakan garam, maka sebelum dicuci dengan pelarut organik, kolom harus dicuci terlebih dahulu dengan air, untuk mencegah kemungkinan terjadinya pengendapan garam tersebut dalam pelarut organik.
IV.1. Kolom Polar
Masalah yang sering dihadapai pada jenis kolom silika dan kolom fasa terikat pola (Amina dan Diol) adalah terjadinya proses deaktifasi. Umumnya proses deaktifasi disebabkan oleh adanya air di dalam eluen yang digunakan. Terjadinya proses deaktifasi ini ditandai oleh berkurangnya waktu retensi dan resolusi pemisahan. Karena proses terikatnya air pada kolom sifatnya reversibel, maka kolom tadi dapat kita keringkan kembali dengan menggunakan berbagai pelarut bebas air. Mula-mula dilakukan terlebih dahulu proses deaktifasi sempurna dengan mengalirkan air ke dalam kolom, dengan maksud mengusir keluar semua pengotor polar yang terkumpul pada kolom yang polar ini. Urutan pelarut yang sebaiknya dialirkan ke dalam kolom dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Pelarut yang dipakai untuk memperbaharui suatu kolom

Pada saat kita melakukan proses aktifasi, semua pelarut organik yang dipakai harus dikeringkan benar-benar, karena jika tidak paking kolom akan mengandung lagi air yang berasal dari pelarut-pelarut organik tersebut. Cara bagaimana mengeringkan pelarut organik ini telah diuraikan sebelumnya.
Bredweg (9) menganjurkan cara mengeringkan kolom silika dan kolom fasa terikat polar menggunakan 2,2 dimetoksi propana. Senyawa ini bereaksi dengan air membentuk aseton dan metanol. 2,2 dimetoksi propana ini digunakan sebagai larutan 2-2,5% dalam kloroform atau heksana. Cara ini mungkin lebih baik karena merupakan cara pengeringan kimia, sedangkan proses aktivasi dengan pelarut merupakan proses fisika yang masih sangat tergantung dari kualitas pelarut yang dipakai (apakah pelarut tersebut benar-benar bebas air atau tidak) dan tergantung pula dari waktu bagi pelarut tersebut melewati kolom.
Perhatian yang khusus hendaknya diberikan untuk kolom fasa terikat amina. Gugus amina pada fasa terikat ini dapat berupa amina primer, sekunder atau tersier, oleh karena itu selektifitas jenis kolom ini dari berbagai perusahaan yang berbeda, sering dijumpai sedikit berbeda. Kolom amina merupakan kolom yang reaktif, setiap gugus fungsi amina dapat dengan mudah berubah menjadi amina kuarterner dengan adanya asam di dalam eluen atau adanya komponen yang bersifat asam di dalam sampel. Gugus amina kuarterner ini dapat diubah kembali ke bentuk asalnya, dengan jalan mengalirkan larutan 0,1 M NH4OH ke dalam kolom. Sebelum dan sesudah mengalirkan NH4OH, kolom harus selalu dialiri air.

IV.2. Kolom Tak Polar
Untuk jenis kolom fasa terikat tak polar digunakan fasa gerak yang sangat polar, karena itu umumnya pengotor yang tertahan di dalam kolom adalah pengotor-pengotor yang sifatnya tak polar. Secara mudahnya dapat disimpulkan bahwa seharusnya pelarut yang paling tidak polar akan dapat mengusir keluar pengotor ini.
Ternyata apa yang terjadi tidaklah semudah itu. Sering didapatkan adanya pengotor lain yang melekat/terikat sangat kuat pada fasa terikat dan/atau pada gugus silanol sisa. Jenis pengotor ini tidak dapat dilepaskan hanya oleh pelarut-pelarut organik, untuk itu dianjurkan agar menggunakan larutan asam kuat (0,1 M H2SO4) (1). Karena dalam hal ini hanya dibutuhkan sejumlah kecil volume asam dan tambahan pula larutan asam kuat tadi hanya berada di dalam kolom untuk jangka waktu 20-30 menit saja, maka pengaruh dari larutan asam yang digunakan tidak akan terlalu membahayakan fasa terikat.
Urutan pelarut yang digunakan untuk mencuci kolom fasa terikat tak polar dapat dilihat pada Tabel 1. Selain dari pelarut yang terdapat dalam tabel, kadang-kadang digunakan pula larutan dimetilsulfoksida (DMSO)

IV.3. Kolom Penukar Ion
Pada kolom penukar ion, pengotor mungkin terikat pada matriks silika, gugus ionik atau gugus alifatik/aromatik yang menghubungkan gugus ionik dengan matriks silika. Karena itu proses pencucian kolom pada penukar ion terdiri dari beberapa tahap.
Pada tahap pertama kita alirkan larutan buffer yang mempunyai kekuatan ion lebih besar dari larutan buffer yang digunakan sebelumnya pada kolom. Maksudnya adalah untuk melepaskan pengotor-pengotor dari gugus ionik. Di sini dapat pula digunakan larutan asam atau larutan basa. Tetapi karena silika gel dapat larut dalam basa, maka pencucian dengan larutan basa ini hanya dapat dilakukan bila :
a.      Digunakan larutan basa lemah
b.      Dipasang pra-kolom pada rangkaian peralatan yang dipakai
Selanjutnya untuk mengusir senyawa–senyawa organik dari kolom dapat digunakan aseton atau metanol. Untuk membersihkan kolom dari pengotor yang tak dikenal yang berasal dari KH2PO4digunakan larutan 0,1 M Na2 EDTA. KH2PO4 banyak digunakan pada pembuatan larutan buffer yang dipakai sebagai eluen pada kolom penukar ion. Pencucian dengan Na2 EDTA dapat pula dilakukan dengan jalan menginjeksikan sejumlah tertentu (100-200 ul) Na2 EDTA dan kemudian ke dalam kolom dialirkan larutan buffer yang encer selama semalam. Di sini dibutuhkan waktu yang agak lama untuk menyetimbangkan kembali kolom tersebut.
Pada Tabel 1 dapat terlihat bahawa pencucian dengan air selalu dilakukan sebelum dan sesudah pencucian menggunakan larutan garam. Hal ini sangat penting karena jika tidak, garam akan terendapkan oleh pelarut organik.
Kesetimbangan pada kolom penukar ion sangat sukat dicapai. Hal ini disebabkan karena pertama, viskositas eluen yang biasa digunakan pada kolom ini relatif besar, sehingga terpaksa kita menggunakan kecepatan aliran yang relatif kecil, dan kedua karena kinetik pertukaran ion berlangsung relatif lambat. Karena alasan inilah kolom penukar ion seringkali harus disetimbangkan selama semalam agar kolom tersebut cukup stabil untuk digunakan pada kesokan harinya.
I.             Pelarut yang Digunakan untuk Menyimpan Kolom
Setelah selesai digunakan, kolom harus selalu dicuci.Larutan asam, basa atau garam tidak boleh dibiarkan berada dalam kolom. Kolom dapat disimpan dalam pelarut organik yang tidak mudah menguap atau dalam air. Umumnya jenis pelarut  yang digunakan harus disesuaikan dengan jenis kolomnya. Sebagai contoh :
1.      Kolom penukar ion disimpan dalam metanol atau air. Metanol lebih disukai karena dapat mencegah pertumbuhan bakteri.
2.      Kolom fasa terikat tak polar disimpan dalam metanol. Asetonitril tidak dianjurkan untuk dipakai di sini karena selain harganya mahal, asetonitril ini dapat terurai membentuk pengotor pada kolom.
3.      Kolom fasa terikat polar disimpan dalam heptana atau metanol.
4.      Kolom silika disimpan dalam heptana.
Karena kolom fasa terikat polar dapat disimpan baik dalam pelarut tak polar ataupun dalam pelarut polar, maka dianjurkan agar di dalam penyimpanannya dipilih jenis pelarut yang mempunyai kepolaran yang hampir sama dengan kepolaran pelarut yang akan digunakan sebagai eluen.

Pelarut yang dipakai untuk menyimpan kolom hendaknya selalu diingat dan dicatat. Jika untuk suatu pemisahan yang akan dilakukan dibutuhkan jenis pelarut yang lain, maka pergantian pelarut hendaknya dilakukan secara perlahan-lahan dan bertahap, sesuai dengan kenaikan atau penurunan polaritas.
Di dalam penyimpanannya jangan sekali-kali kolom dibisrkan kering. Pada kolom yang kering dapat terjadi kekosongan karena paking kolom dapat mengkerut dari dinding kolom atau karena pengerutan paking kolom itu sendiri. Kekosongan pada kolom dapat mengakibatkan terjadinya pelebaran pita, resolusi yang makin buruk dan puncak yang membelah.
Suatu cara yang paling sederhana, kolom dicelupkan pada sebuah gelas ukur yang diisi dengan pelarut tertentu, misalnya heptana untuk jenis kolom silika dan metanol untuk jenis kolom fasa terikat tak polar. Untuk menyimpan kolom ini selalu digunakan 100% pelarut organik (terkecuali kolom penukar ion), dengan maksud mengurangi kelarutan dari silika. Usahakan selalu agar seluruh kolom terendam di dalam pelarutnya.
Cara yang lain adalah dengan menutup kolom rapat-rapat dengan penutup kolom yang terbuat dari logam yang dilengkapi dengan sebuah wadah kecil, dalam mana tersimpan persediaan larutan. Dengan cara ini diharapkan bahwa apabila terjadi kekeringan pada kolom, kolom tersebut dapat secara terus-menerus dibasahi kembali. (Julia Kantasubrata – P3KT – LIPI).

DAFTAR PUSTAKA
1.      Rabel, F.M.,  J. Chromatogr. Sci., 18 (1980) 394
2.      Sampson, R.L.,  Am, Laboratorium. 9 (1977) 109
3.      Jackson, M.T.,  J. Chromatogr. Sci., 15 (1977) 282
4.      Johnson, E.L.,  Stevenson, R.,  Basic Liquid Chromatography. Varian Assiciates, California (1978)
5.      Gloor, R., Johnson, E.l.,  J. Chromatogr. Sci., 15 (1977) 413
6.      Hartwick, R.A.,  Brown, P.R., J. Chromatogr. Sci., 112 (1975) 651
7.      Riss, T.L., Zorich, N.L., Williams, M.D., Richardson, A.,  J. Liq. Chromatogr.,  3 (1980) 133
8.      Atwood, J.G., Schmidt, G.J., Slavin, W., J. Chromatogr. Sci., 171 (1979) 109
9.      Breweg, R.A., Rothman, L.D., Pfeiffer, C.D., Anal. Chem., 51 (1979) 2061.


No comments:

Post a Comment